免疫酶染色法

【資料簡(jiǎn)介】

（一） 原理
免疫酶染色法亦稱免疫酶標(biāo)組織化學(xué)法。標(biāo)本制備后，首先將其內(nèi)源酶抑制，接著即可進(jìn)行免疫酶染色檢查。常規(guī)的免疫酶染色法可分為直接法和間接法兩種。前者固定標(biāo)本中的抗原直接與酶標(biāo)抗體結(jié)合，達(dá)到酶染色目的；后者是抗原先與其抗體（*抗體）結(jié)合后，再與酶標(biāo)抗體（第二抗體）結(jié)合，而進(jìn)行酶染色的。免疫酶染色法的酶底物產(chǎn)物為不溶性物質(zhì)，可沉著于抗原上，使其顯色。間接法雖然多一步驟，但使用范圍廣。此外，酶標(biāo)記第二抗體可用酶標(biāo)記SPA或生物素與親和素系統(tǒng)等代替。

（二） 材料和方法（以檢測(cè)空腸彎曲菌為例）
1 材料
（1） 去除內(nèi)源性酶試劑：1%H2O2甲醇溶液。
（2） 空腸彎曲菌免疫血清（*抗體）：CjC37（雞源）和CjP5（豬源）抗血清，自制。
（3） 驢抗兔IgHRP（第二抗體）：自制。
（4） 稀釋液與洗液（pH值74 PBS）。
（5） 底物溶液（DABH2O2）：
①TrisHCl緩沖液（pH值76，005mol/L）。
②底物溶液，3，3二氨基聯(lián)苯胺50mg、TrisHCl緩沖液100ml、過濾，4℃冰箱保存。用前加H2O2，zui終濃度為03%。
2 方法
（1） 標(biāo)本制備：將疑似空腸彎曲菌病料或其培養(yǎng)物涂片，干燥，然后置除去內(nèi)源性酶試劑中處理及固定10min。
（2） 沖洗：用PBS沖洗1次，瀝干。
（3） 加抗血清：用稀釋液對(duì)CjC37或CjP5抗血清（針對(duì)同源菌）作1∶160稀釋，滴加在玻片上，置37℃于濕盒內(nèi)孵育30min。
（4） 洗滌：3次。
（5） 加酶標(biāo)記抗體：用稀釋液對(duì)驢抗兔IgGHRP作1∶500稀釋，滴加于玻片上，置37℃于濕盒內(nèi)孵育30min。
（6） 洗滌：3次。
（7） 滴加底物溶液：室溫作用20min，用自來水沖洗，終止反應(yīng)，干燥，光學(xué)顯微鏡檢查。

（三） 結(jié)果判定凡菌體被染成棕色或褐色，且形態(tài)彎曲者，均判為空腸彎
曲菌陽(yáng)性；凡2～3個(gè)視野中，未發(fā)現(xiàn)被著色的彎曲形菌體或被鑒定菌不著色，均判為空腸彎曲菌陰性。

（四） 注意事項(xiàng)
1 涂片后，為了防止玻片上的標(biāo)本面反置和號(hào)碼混亂，應(yīng)用一小片橡皮膏貼于玻片一端，并用鉛筆編號(hào)。
2 滴加酶染色試劑時(shí)，玻片應(yīng)瀝干，并且各試劑滴加的量不宜過多，以防溢出。
3 孵育時(shí)，溫箱內(nèi)需放一水槽或?qū)⒉Ｆ脻窈袃?nèi)孵育，防止酶染色試劑蒸發(fā)或干燥。