PCR常見問題分析及對策（無擴增產物、非特異性擴增、拖尾、假陽性）

【資料簡介】

PCR常見問題分析及對策(無擴增產物、非特異性擴增、拖尾、假陽性)
 

問題1：無擴增產物
現象：正對照有條帶，而樣品則無    
原因:
1.模板:含有抑制物，含量低
2.Buffer對樣品不合適
3.引物設計不當或者發生降解
4.反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短
對策:
1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量
2.更換Buffer或調整濃度
3.重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物
4.降低退火溫度、延長延伸時間

 

問題2：非特異性擴增
 

現象：條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶
原因：
1.引物特異性差
2.模板或引物濃度過高
3.酶量過多
4.Mg2+濃度偏高
5.退火溫度偏低
6.循環次數過多
對策：
1.重新設計引物或者使用巢式PCR
2.適當降低模板或引物濃度
3.適當減少酶量
4.降低鎂離子濃度
5.適當提高退火溫度或使用二階段溫度法
6.減少循環次數
 

 

 

 

 

 

 

問題3：拖尾
現象：產物在凝膠上呈Smear狀態。
原因：
1.模板不純
2.Buffer不合適
3.退火溫度偏低
4.酶量過多
5.dNTP、Mg 2+濃度偏高
6.循環次數過多
對策：
1.純化模板
2.更換Buffer
3.適當提高退火溫度
4.適量用酶
5.適當降低dNTP和鎂離子的濃度
6.減少循環次數
 

 

問題4：假陽性
現象：空白對照出現目的擴增產物
原因：
靶序列或擴增產物
的交*污染
對策：
1.操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；
2.除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管
及加樣槍頭等均應一次性使用。
3.各種試劑*行分裝，然后低溫貯存  
 

 

PCR引物設計的黃金法則 （轉自tiangen）
1.引物在模板cDNA的保守區內設計。
DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區

2.引物長度一般在15~30堿基之間。
引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。

3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值接近72℃。
GC含量（composition）過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值接近72℃以使復性條件*。

4.引物3′端要避開密碼子的第3位。
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，選擇T。
引物3′端錯配時，不同堿基引發效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介于A、T之間，所以3′端選擇T。

6. 堿基要隨機分布。
引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。

7. 引物自身及引物之間不應存在互補序列。
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個堿基的互補。
兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。
引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。

8. 引物5′ 端和中間△G值應該相對較高，而3′ 端△G值較低。
△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間△G值相對較高，而3′ 端△G值較低（值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進行分析）

9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。
引物的5′ 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記*、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。
引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。

10. 擴增產物的單鏈不能形成二級結構。
某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時避開二級結構區域。用有關軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

11. 引物應具有特異性。
引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
做Real Time時,用于SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數是不同的。
引物設計的要求：
1)避免重復堿基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端zui后5個堿基內不能有多于2個的G或C.
5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。
6)PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bpzui為合適（可以延長至300 bp）。
7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。
而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
至于設計軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都應該可以的。
做染料法zui關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不容易。
關于BLAST的作用應該是通過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那么這個引物的特異性就很差，從而不能用

 

 

PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。
一.假陰性，不出現擴增條帶
　　PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及活性 ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
　　模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。
　　酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
　　引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。
　　Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
　　反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
　　物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
　　靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
1假陽性
　　出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
　　引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
　　靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或 器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
2出現非特異性擴增帶
　　PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不*互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
3出現片狀拖帶或涂抹帶
　　PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環次數。
二.PCR污染與對策  
    PCR反應的zui大特點是具有較大擴增能力與*的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。
污染原因
　(一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
　(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
　(三)PCR擴增產物污染:這是PCR反應中zui主要zui常見的污染問題，因為PCR產物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。
　還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題.
　(四)實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。污染的監測
　一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
對照試驗
　1.陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)，但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照。
　2.陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。
　3.重復性試驗
  4.選擇不同區域的引物進行PCR擴增
防止污染的方法
(一)合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。能劃分①標本處理區;②PCR反應液制備區;③PCR循環擴增區;④PCR產物鑒定區。其實驗用品及吸樣槍應，實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。
(三)預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復加樣次數，避免污染機會。另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱。
(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。
(五)設立適當的陽性對照和陰性對照，陽性對照以能出現擴增條帶的zui低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。
(六)減少PCR循環次數，只要PCR產物達到檢測水平就適可而止。
(七)選擇質量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內液體濺出。